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基因敲入細胞系(KI)
立即咨詢通過核轉染法將gRNA、Cas9 和Donor 共轉入細胞中，進行藥篩，藥篩完成后挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。
天博克羅地亞官網提供多種類型的基因敲入服務，熒光蛋白定點敲入、蛋白標簽定點敲入、HiBiT定點敲入等等均可構建。
一、KI細胞敲入定制服務
基因敲入細胞服務詳情，超300種細胞成功案例！
| 細胞類型 | 常規細胞系、腫瘤細胞系、IPS/ES等各類細胞 |
|---|---|
| 服務類型 | 熒光/蛋白標等 |
| 交付成果 | 陽性克隆 |
| 周期/價格 | 在線咨詢；添加官方微信號：18520176000（手機同號） |
二、基因敲入細胞方案
(1) 特定位點融合蛋白：
gRNA 和Cas9 復合物造成靶位點DNA 雙鏈斷裂后，細胞以外源攜帶敲入片段的Donor 作為模板進行同源重組修復(HDR), 將敲入片段重組到基因組靶位點。
(2) 敲除特定基因同時敲入外來基因片段：
三、服務流程及質量控制
優化實驗流程，有效提升編輯效率
基因/細胞分析→sgRNA設計與Donor構建→細胞電轉及KO效果鑒定→單克隆化→測序分析→復檢及擴增。
四、AI-CRISPR?技術優勢
1. AI-CRISPR?技術優勢：擁有更高的基因切割效率與同源重組效率，基因編輯效率提升10-20倍。
2. 成熟的技術平臺：大量成功案例，在超300種細胞中成功實現超數千例基因編輯；可提供從細胞基因表達調控、細胞功能驗證及表型分析的全流程服務。
3. 脫靶效率低：采用RNP遞送，相比于質粒或者病毒等基因敲除方法，具有更高的特異性和編輯效率。其能準確靶向目的細胞，提高效率的同時減少非特異的切割；實現Cell pool/純合子交付，快至6周。
4. 應用廣泛：AI-CRISPR?基因編輯輕松實現基因 敲除/點突變/敲入；承諾項目失敗全額退款，成功保障安全無憂。
5. 嚴格的質量控制體系：進行細菌、支原體等微生物的雙重檢測，確保100%無污染，并充分鑒定基因編輯效果；進行細胞活率檢測，保證交付質量。
五、案例分析
1.BEAS-2B細胞背景
BEAS-2B細胞是從肺癌個體的正常人支氣管上皮病理切片分離出的上皮細胞。這個細胞引種自ATCC CRL-9609，又可被稱為支氣管上皮細胞。BEAS-2B細胞系最初是通過使用腺病毒12-SV40雜交病毒感染，并通過連續細胞傳代建立的永生化細胞系，它保留了對血清反應進行鱗關分化的能力，這種能力可用于篩選誘導或影響分化及致癌的化學或生物制劑，因此 BEAS-2B細胞被認為是研究藥物代謝活化作用和呼吸系統腫瘤以及分子機制理想的細胞模型。
2.BEAS-2B的應用
BEAS-2B 細胞在成骨和成脂分化方面與 hMSCs 具有相似的潛力；將細胞分化誘導21天后，用油紅染色分化脂肪細胞中的脂質液泡，然后使用茜素紅染色分化骨細胞中的鈣沉積。結果表明BEAS-2B和在成骨發生或脂肪發生方面均顯示出幾乎相同的陽性染色，這說明BEAS-2B 細胞能像hMSC1細胞一樣能在誘導后表現出很強的骨細胞和脂肪細胞分化能力。
目前，BEAS-2B已被廣泛用于研究肺癌發生的細胞和分子機制，其中包括上皮間質轉化（EMT）在肺癌和肺炎球菌感染中的作用等。此外，BEAS-2B細胞系已被用作體外細胞模型，用于檢測和篩選具有潛在肺毒性或肺部致癌性的各種化學和生物制劑。
3.使用AI-CRISPR?在BEAS-2B細胞中實現基因編輯
基因編輯和細胞模型的建立對于推進功能基因組學、信號通路、新陳代謝、細胞死亡、藥物發現、藥物反應和癌癥研究等領域具有重要的意義。BEAS-2B細胞作為研究藥物代謝活化作用和呼吸系統腫瘤以及分子機制的理想細胞模型，已經有許多研究人員利用CRISPR/Cas9技術對其進行編輯以研究癌癥特征、耐藥機制的披露、癌癥治療、細胞死亡研究、功能基因組學、信號通路、藥物發現、藥物反應和細胞治療等多種具有重要意義的課題。
天博克羅地亞官網研發的AI-CRISPR?（基于CRISPR/Cas9技術）在DNA雙鏈的切割上比一般的CRISPR/Cas9系統更有效率，不僅可以顯著提高同源重組的效率，還能同時在體內外實現高效的基因編輯，對于BEAS-2B細胞的基因編輯實驗有著極大的優勢。
圖1 使用AI-CRISPR?在BEAS-2B細胞中基因編輯過程
3.1 基因敲入或基因點突變BEAS-2B細胞系
BEAS-2B細胞通過電穿孔法與gRNA、Cas9和Donor載體共轉染，然后挑單克隆。陽性克隆將通過測序進行驗證。具體案例如下：
圖3 BEAS-2B細胞系的敲入策略
（1）敲入案例
為了研究突變體NRASQ61K在血管再生中的特異性影響，在正常（非腫瘤）人支氣管上皮細胞(BEAS-2B)中進行了敲入。與野生型(WT)細胞相比，在CAM上生長的NRASQ61K過表達細胞的特征是血管系統紊亂，并存在若干個出血區域。為了證實體內NRASQ61K的促血管生成作用，在裸鼠身上進行了Matrigel plug試驗，結果如圖5B中所示，NRASQ61K表達細胞顯示出血管再生明顯增加，呈亮紅色。然而，野生型細胞中的血管再生可以忽略不計，并且血紅蛋白水平較低。除此之外，研究者還發現NRASQ61K在體外的表達顯著增加了類毛細管網絡，如圖5C所示。而腫瘤血管生成的關鍵所在正是細胞在骨髓上自發形成毛細血管樣結構，因此，NRASQ61K的表達會在一定程度上促進腫瘤血管的生成。
圖5 將NRASQ61K敲入BEAS-2B細胞
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