一、點(diǎn)突變細(xì)胞（PM）定制服務(wù)

相比于傳統(tǒng)的HDR（Homologous Directed Recombination），BE和PE基因堿基編輯系統(tǒng)，無需DSB即可實(shí)現(xiàn)編輯，因此更加高效、安全。 

基因堿基編輯BE（Base editing）技術(shù)提供了不引入DNA雙鏈斷裂和外源工體DNA模板的條件下，就可以對(duì)單堿基進(jìn)行轉(zhuǎn)換的可能性。BE基因編輯系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)4種單堿基編輯（C→T, G→A, A→G, T→C）;但仍有8種編輯不能實(shí)現(xiàn)（C→A, C→G, G→C, G→T, A→C, A→T, T→A, T→G）。

先導(dǎo)編輯PE (Prime Editing) 基因定點(diǎn)突變技術(shù)最高效、最安全的，相比于CBE和ABE單堿基編輯器；PE最大的優(yōu)勢(shì)在于多樣的編輯類型，包括多位點(diǎn)編輯、DNA短片段插入和缺失（<100bp）。艾森基因凝聚十多年基因編輯經(jīng)驗(yàn)，在上千例基因編輯細(xì)胞項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)中總結(jié)、優(yōu)化、提升，成功率遠(yuǎn)超傳統(tǒng)基因定點(diǎn)突變系統(tǒng)。

二、點(diǎn)突變方案

CRISPR/Cas9（HDR）

PE（Prime Editing）

CBE：嘧啶堿基轉(zhuǎn)換技術(shù)（C/G到T/A）

ABE：嘧啶堿基轉(zhuǎn)換技術(shù)（A/T到G/C）

PE（Prime Editing）

Step1：pegRNA是設(shè)計(jì)一段帶有轉(zhuǎn)錄模板（攜帶想要的基因信息）和必要Prime Binding Site（PBS）的 PE 編輯專用 gRNA。

Step2：Cas9切口酶在pegRNA上的sgRNA序列指引下，切割DNA單鏈，pegRNA 3′-端的PBS（引物結(jié)合序列）可以與切割斷點(diǎn)前的互補(bǔ)序列識(shí)別配對(duì)。

Step3：逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV RT）以pegRNA上PBS序列后的人工設(shè)計(jì)的模板序列為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，將目標(biāo)序列直接聚合到切口的DNA鏈上。

Step4：編輯后的DNA 雙鏈延伸出一段額外新合成的 DNA Flap，啟動(dòng)細(xì)胞自有的3‘flap-5’flap equilibration 機(jī)制，將 DNA 原有的片段切除。

Step5：不匹配的DNA 雙鏈通過錯(cuò)配修復(fù)（mismatch repair，MMR）機(jī)制，把非編輯鏈修復(fù)，整個(gè)編輯過程就完成了。

三、服務(wù)流程及質(zhì)量控制

基因/細(xì)胞分析→sgRNA設(shè)計(jì)/oligo合成或Donor構(gòu)建→細(xì)胞電轉(zhuǎn)及PM效果鑒定→單克隆化→測(cè)序分析→復(fù)檢及擴(kuò)增。

四、AI-CRISPR?技術(shù)優(yōu)勢(shì)

1. AI-CRISPR?技術(shù)優(yōu)勢(shì)：擁有多種方案實(shí)現(xiàn)細(xì)胞點(diǎn)突變；滿足不同客戶需求；具有更高的基因切割效率與同源重組效率，基因編輯效率提升10-20倍。

2. 成熟的技術(shù)平臺(tái)：大量成功案例，在超300種細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)超數(shù)千例基因編輯；可提供從細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞功能驗(yàn)證及表型分析的全流程服務(wù)。

3. 應(yīng)用廣泛：AI-CRISPR?基因編輯輕松實(shí)現(xiàn)基因 敲除/點(diǎn)突變/敲入；承諾項(xiàng)目失敗全額退款，成功保障安全無憂。

4. 嚴(yán)格的質(zhì)量控制體系：進(jìn)行細(xì)菌、支原體等微生物的雙重檢測(cè)，確保100%無污染，并充分鑒定基因編輯效果；進(jìn)行細(xì)胞活率檢測(cè)，保證交付質(zhì)量。

五、突變位置分類

1. 編碼區(qū)域

a. 沉默突變：盡管序列發(fā)生了變化，這種突變通常會(huì)導(dǎo)致整合進(jìn)多肽鏈中的氨基酸沒有發(fā)生變化，這種點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)沒有影響，也因此被稱為沉默突變。

b. 錯(cuò)義突變：導(dǎo)致不同的氨基酸會(huì)被整合進(jìn)多肽鏈中。錯(cuò)義突變的影響取決于突變后新的氨基酸與野生型氨基酸在化學(xué)上的差異。

c. 無義突變：是指將編碼氨基酸的密碼子（有義密碼子）轉(zhuǎn)換為終止密碼子（無義密碼子）。無義突變會(huì)導(dǎo)致合成出來的蛋白質(zhì)會(huì)比野生型的要短，并且編碼出來的蛋白通常不起作用。

2. 非編碼區(qū)：在基因的非編碼區(qū)內(nèi)的突變實(shí)際上是可以影響基因的表達(dá)和功能的。

a. 內(nèi)含子可能包含某些序列，這些序列會(huì)結(jié)合其他可轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子或沉默子（但這些元件的不是基因所必需的包含），因此在這些區(qū)域中形成的突變是有可能影響基因的轉(zhuǎn)錄。

b. 內(nèi)含子還包含非編碼RNA的序列（如miRNA，lincRNA），這些序列可能會(huì)影響所在基因（和/或其他基因）的mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。當(dāng)突變改變這些RNA的加工或序列的時(shí)候，一定會(huì)改變基因產(chǎn)物的產(chǎn)生量。

c. 在剪接過程中，內(nèi)含子會(huì)有更高級(jí)別的調(diào)節(jié)。當(dāng)內(nèi)含子中的剪接信號(hào)發(fā)生了突變（剪接因子結(jié)合的地方），這有可能會(huì)改變內(nèi)含子這一調(diào)節(jié)功能。在這些區(qū)域中的突變可能導(dǎo)致產(chǎn)生差異剪接或截短的產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物可能是不起作用的，甚至有了不同的功能。

d. 在翻譯水平上，UTR參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的活性，因此在UTR（非編碼區(qū)）的突變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的生產(chǎn)量。

六、案例分析

種屬	人
細(xì)胞名稱	HCT116細(xì)胞
基因/位點(diǎn)	基因：CTNNB1；突變位點(diǎn)：c.98C>T
培養(yǎng)體系	DMEM-H＋10% FBS＋1% P/S
基因型檢測(cè)	針對(duì)gRNA打靶位置及其附近基因組序列進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與理論序列一致
細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)	1530v , 20ms ,1次；電轉(zhuǎn)體系：10 uL
克隆形成率	細(xì)胞增殖能力較好
PCR篩選	篩選克隆數(shù)量：175； 雜合子數(shù)量：18；純合子數(shù)量：3
PCR方案1
電泳圖示例1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果	單克隆測(cè)序結(jié)果顯示，突變成功
克隆狀態(tài)