《STING inhibits the reactivation of dormant metastasisinlung adenocarcinoma》

背景：從原位瘤脫落下來的腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中絕大多數(shù)會(huì)被免疫系統(tǒng)消滅，但仍有少部分細(xì)胞逃過免疫系統(tǒng)的識(shí)別并且在其他器官中駐扎，進(jìn)入休眠期，這類細(xì)胞稱為播散性腫瘤細(xì)胞（disseminated tumor cell, DTC）。處于休眠期的DTC會(huì)下調(diào)NK細(xì)胞活性配體以及MHC-I的表達(dá)，以此來躲避NK細(xì)胞和T細(xì)胞的識(shí)別。在一段時(shí)間的休眠后，這些細(xì)胞會(huì)重啟增殖進(jìn)入轉(zhuǎn)移初期（incipient metastasis）階段，該階段的DTC處于免疫逃逸以及易被免疫系統(tǒng)識(shí)別的平衡狀態(tài)中。最終DTC逃過免疫系統(tǒng)識(shí)別，爆發(fā)性增殖，形成新的轉(zhuǎn)移瘤（macrometastasis）。

該研究主要聚焦于找出抑制轉(zhuǎn)移初期腫瘤細(xì)胞爆發(fā)的免疫因子。研究通過CRIPSRKO文庫(kù)篩選免疫激活因子，比較轉(zhuǎn)移初期與形成新的轉(zhuǎn)移瘤后的細(xì)胞之間的差異，發(fā)現(xiàn)STING信號(hào)抑制了肺腺癌細(xì)胞的休眠轉(zhuǎn)移再激活。

圖1 腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移逃逸模型[1,2]

這篇研究CRISPR文庫(kù)篩選詳細(xì)流程如下：

第一步: 設(shè)計(jì)sgRNA文庫(kù)——根據(jù)研究目的定制針對(duì)性強(qiáng)的sgRNA文庫(kù)（文庫(kù)小而精）。

由于研究主要目的是為了尋找DTC能夠?qū)崿F(xiàn)免疫逃逸的相關(guān)基因，該研究的sgRNA文庫(kù)主要圍繞DTC細(xì)胞自身免疫激活相關(guān)基因進(jìn)行設(shè)計(jì)。文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的sgRNA包含3個(gè)部分，共涵蓋220個(gè)基因：

1.  NK細(xì)胞活性配體和MHC-I相關(guān)基因（DTC會(huì)通過二者被NK細(xì)胞和T細(xì)胞識(shí)別與殺傷）；

2.  干擾素α/γ以及補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)基因（scRNA-Seq比較轉(zhuǎn)移早期細(xì)胞和爆發(fā)后細(xì)胞之間DEGs，并通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)通路顯著富集）；

3.  STING、RNA以及脂多糖信號(hào)通路基因（這些通路位于干擾素α上游）。

4. 為了確保文庫(kù)細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)的代表性，研究團(tuán)隊(duì)將上述基因分為若干個(gè)亞文庫(kù)（每個(gè)亞文庫(kù)靶向20個(gè)基因，每個(gè)基因設(shè)計(jì)5條sgRNA）

第二步：文庫(kù)轉(zhuǎn)染

該研究采用人早期肺腺癌細(xì)胞系（H2087-LCC和KPad1）。為確保文庫(kù)細(xì)胞的高代表性，研究采用MOI = 0.3，覆蓋度>1000x的條件，通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式將亞文庫(kù)分別轉(zhuǎn)入不同細(xì)胞群中。經(jīng)嘌呤霉素（2.5 μg/mL，4天）抗性篩選后，獲得不同亞文庫(kù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

第三步：制定合適的篩選方案

1）將小鼠腫瘤模型與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，篩選靶細(xì)胞；2）兩種不同細(xì)胞的平行實(shí)驗(yàn)，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果說服力。

該研究旨在找出轉(zhuǎn)移初期癌細(xì)胞到爆發(fā)期細(xì)胞之間的差異。團(tuán)隊(duì)早期研究表明，將早期肺腺癌細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠中會(huì)使其轉(zhuǎn)移至多器官并快速爆發(fā)增殖。因此選擇將早期肺腺癌細(xì)胞注射至免疫缺陷小鼠中，促使其爆發(fā)。再通過流式細(xì)胞術(shù)分選出不同器官中已爆發(fā)的癌細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

① 細(xì)胞類型：早期肺腺癌細(xì)胞（H2087-LCC和KPad1）

② 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?：免疫缺陷小鼠

③ 比較對(duì)象：轉(zhuǎn)移早期DTC（對(duì)照組）和爆發(fā)后DTC（實(shí)驗(yàn)組）

④ 處理?xiàng)l件：心臟注射或尾靜脈注射細(xì)胞，活體成像觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，直至其爆發(fā)

⑤ 篩選方式：收取不同組織，通過流式細(xì)胞術(shù)分選帶熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞

圖2 CRISPR文庫(kù)篩選流程圖[1]

第四步：生信分析尋找靶基因——兩平行實(shí)驗(yàn)組測(cè)序結(jié)果的比較分析，找到共同靶點(diǎn)。

通過生信比較分析不同組織中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的sgRNA差異，研究者發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞活性配體和MHC-1對(duì)應(yīng)的sgRNA富集程度最高；由于已有研究表明NK細(xì)胞和T細(xì)胞抑制休眠期細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，說明篩選結(jié)果的可靠性。進(jìn)一步組合分析比較兩種早期肺腺癌細(xì)胞之間的sgRNA差異，研究者發(fā)現(xiàn)，STING信號(hào)以及STING信號(hào)下游基因都是sgRNA的主要靶點(diǎn)。

圖3 生信分析篩選靶點(diǎn)[1]

A. H2087-LCC細(xì)胞注射組，不同組織中sgRNA富集程度；B. Kpad1細(xì)胞注射組，不同組織中sgRNA富集程度；C. 上述兩組細(xì)胞的sgRNA富集分析。

第五步：靶點(diǎn)驗(yàn)證

作者首先借助免疫熒光確認(rèn)了STING信號(hào)在轉(zhuǎn)移初期的肺腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，隨后分別通過Sting基因敲除以及過表達(dá)分別在免疫缺陷小鼠上證明STING信號(hào)與轉(zhuǎn)移初期腫瘤細(xì)胞再激活之間的關(guān)系。抑制STING信號(hào)會(huì)促進(jìn)轉(zhuǎn)移初期腫瘤細(xì)胞的爆發(fā)性增殖，而增強(qiáng)STING信號(hào)則能減緩其增殖。

圖四 STING靶點(diǎn)驗(yàn)證[1]

A&B. 兩種細(xì)胞中STING信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比。相較于休眠期細(xì)胞（Ki67low），轉(zhuǎn)移初期細(xì)胞（Ki67high）的STING信號(hào)顯著增加；C. 敲除KPad1細(xì)胞中Sting基因后，腫瘤細(xì)胞增殖顯著增加；D. Tet-On系統(tǒng)過表達(dá)Sting基因后，腫瘤細(xì)胞增殖被顯著抑制；E. 敲除Sting基因后，各器官中的腫瘤細(xì)胞均明顯增殖。

總結(jié)：進(jìn)行CRISPR文庫(kù)篩選的步驟：1）選擇sgRNA文庫(kù)；目前市面上提供全基因組文庫(kù)和靶向多種信號(hào)通路的亞文庫(kù)可以滿足大部分科研人的需求，當(dāng)然也可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需求定制文庫(kù)（如通過RNA-Seq篩選出的DEGs，KEGG、GO、GSEA分析等找出候選基因群）。2）制定篩選方案；根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需求，考慮藥物篩選條件（濃度、時(shí)間）、細(xì)胞篩選方式（陽(yáng)/陰性篩選、體內(nèi)/外篩選、流式分選）以及比較對(duì)象（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）等因素，制定合理的篩選方案。3）生信分析；通過比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異基因富集程度篩選潛在靶點(diǎn)。4）通過基因敲除或過表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行靶點(diǎn)功能驗(yàn)證，亦或是下游信號(hào)通路機(jī)制的進(jìn)一步研究。